权利要求
1.一种用于治理矿山尾矿污染土壤的复合微生物菌剂，其特征在于，包括体积比为1~2：1~2的含科萨克氏菌(Kosakonia sacchari )P1-4的菌液和含寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)R5的菌液，其中，含科萨克氏菌(Kosakonia sacchari )P1-4的菌液和含寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)R5的菌液的OD600值独立为0.5~1.5;
其中，科萨克氏菌(Kosakonia sacchari )P1-4保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年09月20日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M20231759;
寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)R5保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年09月20日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M 20231758。
2.一种用于治理矿山尾矿污染土壤的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将科萨克氏菌(Kosakonia sacchari )P1-4接种到LB培养基中，震荡培养，培养结束后离心去除上清液，调整菌体的OD600值为0.5~1.5，得到含科萨克氏菌(Kosakonia sacchari )P1-4的菌液;
(2)将寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)R5接种到LB培养基中，震荡培养，培养结束后离心去除上清液，调整菌体的OD600值为0.5~1.5，得到含寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)R5的菌液;
(3)将含科萨克氏菌(Kosakonia sacchari )P1-4的菌液和含寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)R5的菌液按照1~2：1~2的体积比混合，得到所述复合微生物菌剂。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，震荡培养的条件包括培养的温度为26℃~30℃，时间为10h~14h，转速为180rpm~220rpm。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，离心的转速为5800rpm~6200rpm，离心的时间为2min~4min。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，震荡培养的条件包括培养的温度为26℃~30℃，时间为10h~14h，转速为180rpm~220rpm。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，离心的转速为5800rpm~6200rpm，离心的时间为2min~4min。
7.一种如权利要求1所述的复合微生物菌剂或者由权利要求2～6中任一项所述的制备方法制备得到的复合微生物菌剂在矿山尾矿污染土壤治理中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，每立方米矿山尾矿污染土壤中施入8~12L的复合微生物菌剂。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述矿山尾矿污染土壤主要是指镉或/和铅污染的土壤。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述矿山尾矿污染土壤的pH值为4~4.5，有效态镉含量为0.5~0.7mg/kg，有效态铅含量为7~9mg/kg，有机质含量为5~7mg/kg。
说明书
技术领域
[0001]本发明属于土壤微生物防治技术领域，尤其涉及一种用于治理矿山尾矿污染土壤的复合微生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
[0002]矿山开采过程中产生的尾矿中含有大量重金属(如镉、铅等)和其他有害物质，对生态环境造成严重污染。为治理此类污染，传统上主要依赖物理和化学方法，例如：
物理方法：包括客土、换土、隔离填埋等。这些方法虽能快速见效，但工程量大、成本高昂，仅适用于小范围污染，且未从根本上消除污染物，存在二次处置和污染转移的风险。
[0003]化学方法：如化学固定/稳定化、淋洗、氧化还原等。该方法通过添加化学试剂改变重金属的形态或溶解性，同样存在处理成本高、可能破坏土壤结构、引入新的化学物质造成二次污染，且长期稳定性不确定等问题。
[0004]鉴于传统方法的局限性，利用微生物进行生物修复因其环境友好、成本相对较低、修复过程温和且具有生态可持续性等优点，近年来受到广泛关注。然而，尽管微生物修复技术前景广阔，但其在复杂尾矿污染土壤的实际应用中受限于微生物特性与尾矿环境的复杂性，大多数采用微生物进行修复，其修复的效果有限，并且效率低下。因此，开发一种微生物菌剂以提高治理效果显得尤为重要。
发明内容
[0005]本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种用于治理矿山尾矿污染土壤的复合微生物菌剂及其制备方法和应用。
[0006]为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种用于治理矿山尾矿污染土壤的复合微生物菌剂，包括体积比为1~2：1~2的含科萨克氏菌(Kosakonia sacchari )P1-4的菌液和含寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)R5的菌液，其中，含科萨克氏菌(Kosakonia sacchari )P1-4的菌液和含寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)R5的菌液的OD600值独立为0.5~1.5;
其中，科萨克氏菌(Kosakonia sacchari )P1-4保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年09月20日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M20231759;
寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)R5保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年09月20日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M20231758。
[0007]基于一个总的发明构思，本发明还提供一种用于治理矿山尾矿污染土壤的复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将科萨克氏菌(Kosakonia sacchari )P1-4接种到LB培养基中，震荡培养，培养结束后离心去除上清液，调整菌体的OD600值为0.5~1.5，得到含科萨克氏菌(Kosakonia sacchari )P1-4的菌液;
(2)将寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)R5接种到LB培养基中，震荡培养，培养结束后离心去除上清液，调整菌体的OD600值为0.5~1.5，得到含寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)R5的菌液;
(3)将含科萨克氏菌(Kosakonia sacchari )P1-4的菌液和含寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)R5的菌液按照1~2：1~2的体积比例混合，得到所述复合微生物菌剂。
[0008]上述的制备方法，优选的，步骤(1)中，震荡培养的条件包括培养的温度为26℃~30℃，时间为10h~14h，转速为180rpm~220rpm。震荡培养的温度进一步优选为28℃，震荡培养的时间进一步优选为12h，OD600值进一步优选为1.0。
[0009]上述的制备方法，优选的，步骤(1)中，离心的转速为5800rpm~6200rpm，离心的时间为2min~4min。
[0010]上述的制备方法，优选的，步骤(2)中，震荡培养的条件包括培养的温度为26℃~30℃，时间为10h~14h，转速为180rpm~220rpm。震荡培养的温度进一步优选为28℃，震荡培养的时间进一步优选为12h，OD600值进一步优选为1.0。
[0011]上述的制备方法，优选的，步骤(2)中，离心的转速为5800rpm~6200rpm，离心的时间为2min~4min。
[0012]基于一个总的发明构思，本发明还提供一种如上述的复合微生物菌剂或者由上述的制备方法制备得到的复合微生物菌剂在矿山尾矿污染土壤治理中的应用。
[0013]上述的应用，优选的，每立方米矿山尾矿污染土壤中施入8~12L的复合微生物菌剂。
[0014]上述的应用，优选的，所述矿山尾矿污染土壤主要是指镉或/和铅污染的土壤。
[0015]上述的应用，优选的，所述矿山尾矿污染土壤的pH值为4~4.5，有效态镉含量为0.5~0.7mg/kg，有效态铅含量为7~9mg/kg，有机质含量为5~7mg/kg。
[0016]与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明所筛选的科萨克氏菌(Kosakonia sacchari )P1-4与寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)R5均源自耐镉环境(芒草根际、水稻内生)，对重金属胁迫具有天然的耐受性;将其复配后制成的菌剂，对矿山尾矿区典型的酸性、镉铅复合污染土壤表现出极强的适应性和修复针对性，解决了普通微生物菌剂在恶劣的尾矿环境中存活率低、功能失效的普遍难题。
[0017](2)本发明首次将菌株科萨克氏菌(Kosakonia sacchari)P1-4与寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)R5进行复配，对矿山尾矿污染土壤中的镉(Cd)和铅(Pb)有显著的固定化效果，且复配菌剂能更有效地提升污染土壤的pH值，并增加土壤有机质含量，从而从本质上改善土壤微生态环境，更利于长期稳定修复。
[0018](3)本发明完全基于微生物自身的生命活动(如吸附、积累、转化等)实现对重金属的固定与钝化，整个修复过程不引入任何外源化学药剂，避免了传统化学固化方法可能带来的土壤板结、盐碱化及二次化学污染风险。修复后微生物可成为土壤生态系统的一部分，生态安全性高。
[0019]生物保藏说明
本申请涉及到的寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)R5，于2023年9月20日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址:中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M20231758;
本申请涉及到的科萨克氏菌(Kosakonia sacchari)P1-4，于2023年9月20日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M20231759。
附图说明
[0020]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0021]图1是本发明筛选出的15种细菌筛选培养结果图。
具体实施方式
[0022]为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
[0023]除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
[0024]除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
[0025]下文的培养基及其配方包括：
1/2LB液体培养基：称取氯化钠5.0 g、酵母提取物2.5 g、胰蛋白胨5.0 g，用超纯水定容至1000 mL，将pH值调至7.0，高压蒸汽灭菌法121℃条件下灭菌30分钟，冷却后使用。
[0026]LB液体培养基：称取氯化钠10.0 g、酵母提取物5.0 g、胰蛋白胨10.0 g，用超纯水定容至1000 mL，将pH值调至7.0，高压蒸汽灭菌法121℃条件下灭菌30分钟，冷却后使用。
[0027]NB液体培养基：称取葡萄糖10.0 g、牛肉膏3.0 g、蛋白胨5.0 g，用超纯水定容至1000 mL，将pH值调至7.0，分装至三角瓶中封口用高压蒸汽灭菌法121℃条件下灭菌30分钟，冷却后使用。
[0028]1/2LB固体培养基：称取氯化钠5.0 g、酵母提取物2.5 g、胰蛋白胨5.0 g，用超纯水定容至1000 mL，将pH值调至7.0，加入琼脂15 g，高压蒸汽灭菌法 121℃条件下灭菌30分钟，冷却到50℃倒平板。
[0029]LB固体培养基：称取氯化钠10.0 g、酵母提取物5.0 g、胰蛋白胨10.0 g，用超纯水定容至1000 mL，将pH值调至7.0，加入琼脂15 g，高压蒸汽灭菌法 121℃条件下灭菌30分钟，冷却到50℃倒平板。
[0030]NB固体培养基：称取葡萄糖10.0 g、牛肉膏3.0 g、蛋白胨5.0 g，用超纯水定容至1000 mL，将pH值调至7.0，加入琼脂15 g，高压蒸汽灭菌法121℃条件下灭菌30分钟，冷却到50℃倒平板。
[0031]实施例1：
本实施例是菌株的分离和鉴定。
[0032]1、科萨克氏菌(Kosakonia sacchari )P1-4的分离培养
在湘江排污口处，选取生长旺盛的芒草，将其连同根系拔出，抖落根系表面松散的土壤，采集紧密附着在根系表面的土(根际土)，将其装入预先准备好的无菌袋中密封，迅速带回实验室置于4℃冰箱保存。
[0033]称取土壤5g，放入盛45mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，震荡20分钟，使土样与水充分混合，然后静置，分别吸取1mL上清液稀释1×104、1×105和1×106倍后，再分别吸取100μL稀释后的上清液涂布在LB固体培养基上，置于恒温培养箱中(28℃)倒置培养，定时观察平板上菌株的生长情况。待菌株生长5天后，用接种环挑选平板上各种形态特征(颜色、大小、形态等)有差异的菌株，在LB固体培养基上划线培养，筛选到9株内生细菌，分别命名为：P1-1、P1-2、P1-3、P1-4、P1-5、P1-6、P1-7、P1-8、P1-9。将单菌活化后，按照菌液：无菌甘油=1：1的比例混匀吸取1.5mL分装至2mL的离心管中，放置-80℃冰箱保存备用。
[0034]2、寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)的分离培养
选取贵州省凯里市舟溪镇地区的饱满充实的黄华占水稻种子，先用75%的无水乙醇浸泡10分钟后，将无水乙醇倒出，用灭菌水清洗5次，再用5%的NaClO浸泡10分钟后，用灭菌水清洗5次。吸取100 μL最后漂洗水稻种子的灭菌水涂布在1/2 LB固体培养基上，放置恒温培养箱中培养5天，观察培养基上是否有菌株生长，以确保水稻种子表面消毒灭菌彻底。
[0035]采用1/2 LB、NB液体培养基对水稻种子内生细菌进行分离。将表面消毒后的水稻种子放到灭菌研钵中加入少量液氮充分研磨至粉末状后，用灭菌后的称量勺将水稻种子粉末分别接种至250 mL的1/2 LB、NB液体培养基中，置于摇床中(28 ℃，180 rpm/min)培养36小时后，分别吸取1mL菌液稀释1×104、1×105和1×106倍后，再分别吸取100 μL菌悬液涂布在对应的固体培养基上，置于恒温培养箱中(28 ℃)倒置培养，定时观察平板上菌株的生长情况。待菌株生长5天后，用接种环挑选平板上各种形态特征有差异的菌株，在对应的固体培养基上划线培养，筛选到6株细菌，编号R1、R2、R3、R4、R5、R6，将单菌活化后，按照菌液：无菌甘油=1：1的比例混匀吸取1.5 mL分装至2 mL的离心管中，放置-80 ℃冰箱保存备用。
[0036]通过芒草根际土壤及黄华占水稻种子共分离得到15种不同形态的细菌，将上述分离筛选出来细菌分别接种至LB液体培养基中，置于摇床中(28℃，180rpm)培养36小时。分别取100μL菌悬液涂布至Cd浓度为4mmol/L的LB固体培养基上，放至28℃恒温培养箱中倒置进行筛选培养，在7天后观察其生长情况，各细菌筛选培养结果如图1所示。
[0037]由图1可知，P1-4、R5菌培养皿表面有较为密集的菌落，其他培养皿则相对没有明显或仅有极少量菌落。说明P1-4、R5菌具有一定的耐镉性，选择P1-4、R5菌细菌进行后续研究。
[0038]R5菌呈圆形，边缘整齐，半球形隆起，质地饱满，表面光滑湿润，乳白色，黏液状，挑取时拉丝，为革兰氏阴性菌。P1-4菌颜色整体为浅色，形态上呈现出较为密集的分布状态，存在大量微小的菌落聚集在一起，形成一片相对集中的菌落区域，也为革兰氏阴性菌属。
[0039]将分离筛选出来的R5、P1-4分别接种至LB液体培养基中活化，使用高速冷冻离心机离心后收集菌体，使用细菌DNA提取试剂盒按照说明书提取菌株DNA。将菌株DNA送至扩增产物送至湖南赛思维生物科技有限公司测序鉴定，得到细菌的基因序列后与NCBI数据库进行在线比对，以鉴定内生细菌的种属。
[0040]结果发现，R5菌株为Stenotrophomonas sp.(寡养单胞菌)，命名为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)R5，于2023年9月20日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址:中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20231758。
[0041]P1-4菌株为科萨克氏菌属的菌株，拉丁学名为Kosakonia sacchari，将其命名为科萨克氏菌(Kosakonia sacchari)P1-4，于2023年9月20日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 20231759。
[0042]其中，P1-4菌的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示，具体序列为：
TTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAGGTTAATAACCTTATTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTCGTAGAGGGAGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCTCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCTATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATAGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGTAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAACCTGCGGTTGGATCACCTCCTT。
[0043]实施例2：
本实施例是为了验证寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)R5菌株和科萨克氏菌(Kosakonia sacchari)P1-4菌株在共培养的情况下是否稳定共存。
[0044]分别挑取寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)R5菌株和科萨克氏菌(Kosakonia sacchari)P1-4菌株的单菌落，接种至5mL LB液体培养基中，28℃、180rpm恒温振荡培养12h，分别获得R5菌液和P1-4菌液。采用紫外分光光度计测定菌液OD600值，并用LB液体培养基调整至OD600=0.05，备用。
[0045]实验设置3组，每组3个生物学重复，每重复体系为50mL LB液体培养基，具体分组如下：
对照组1(R5单一培养组)：接种5mL调整后的R5菌液，接种量10%(v/v);
对照组2(P1-4单一培养组)：接种5mL调整后的P1-4菌液，接种量10%(v/v);
实验组(R5+P1-4共培养组)：分别接种2.5mL调整后的R5菌液和2.5mL调整后的P1-4菌液，总接种量10%(v/v)，二者接种比例1:1。
[0046]将上述3组培养体系置于37℃、180r/min恒温振荡培养箱中培养，分别在培养0、2、4、6、8、12、24、48h时取样，每个时间点每组取3个重复样。
[0047]活菌数计数：取各时间点样品，用无菌生理盐水进行梯度稀释(10-1~10-8)，分别取100μL稀释液均匀涂布于LB固体培养基上，28℃恒温培养24h后，根据R5菌落和 P1-4菌落形态特征统计菌落数(CFU)，计算每毫升样品中的活菌数(CFU/mL)，结果件表1所示。
[0048]表1 各处理样品中的活菌数(CFU/mL)
[0049]由表1数据可知，共培养组中R5菌株在12h时的活菌数为1.01×108CFU/mL;P1-4菌株在12h时的活菌数为1.00×108CFU/mL，均满足预期生长指标。共培养组中R5菌株在24h时的活菌数为1.92×108CFU/mL，较单一培养组(1.85×108CFU/mL)提升3.8%;P1-4菌株在24h时的活菌数为1.88×108CFU/mL，较单一培养组(1.82×108CFU/mL)提升3.3%，证明二者共培养具有生长协同效应。48h时，共培养组R5和P1-4菌株活菌数仍维持在1.89×108CFU/mL和1.85×108CFU/mL的较高水平，未出现明显衰亡，这进一步说明R5菌株和P1-4菌株在共培养的情况能够稳定共存。
[0050]实施例3：
一种复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将实施例1筛选的科萨克氏菌(Kosakonia sacchari )P1-4接种到LB液体培养基中，在28℃下以200rpm的转速震荡培养12h，然后以6000rpm离心速率离心3min，去除上清液，收集菌体，用无菌水重悬，并调整菌悬液的OD600值至1.0，得到含科萨克氏菌(Kosakonia sacchari )P1-4的菌液;
(2)将实施例1筛选的寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)R5接种到LB液体培养基中，在28℃下以200rpm的转速震荡培养12h，然后以6000rpm离心速率离心3min，去除上清液，收集菌体，用无菌水重悬，并调整菌悬液的OD600值至1.0，得到含寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)R5的菌液。
[0051](3)含科萨克氏菌(Kosakonia sacchari )P1-4的菌液和含寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)R5的菌液分别按照体积比为2：1、1：1和1：2的比例混合成复合微生物菌剂。
[0052]将上述制备的3种复合微生物菌剂和分别只含科萨克氏菌(Kosakonia sacchari )P1-4的菌液(OD600值为1.0)、只含寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)R5的菌液(OD600值为1.0)进行对比矿山尾矿污染土壤。
[0053]实验分组：对照组(不做任何处理);
处理组1：采用单P1-4菌液的微生物菌剂处理;
处理组2：采用单R5菌液的微生物菌剂处理;
处理组3：采用P1-4菌液和R5菌液体积比为2：1的微生物菌剂处理;
处理组4：采用P1-4菌液和R5菌液体积比为1：1的微生物菌剂处理;
处理组5：采用P1-4菌液和R5菌液体积比为1：2的微生物菌剂处理。
[0054]实验方法：选取矿山尾矿污染土壤，按照每立方米矿山尾矿污染土壤10L菌剂的量将不同处理组的微生物菌剂加入到矿山尾矿污染土壤中，搅拌均匀，30天后取样检测土壤的pH值、有效态镉含量、有效态铅含量和有机质含量，其中有效态镉、铅含量参照《土壤 8种有效态元素的测定 二乙烯三胺五乙酸浸提-电感耦合等离子体发射光谱法(HJ 804-2016)》中规定的方法进行检测，有机质含量参照《NY/T 1121.6-2006 土壤检测 第6部分：土壤有机质的测定》中规定的方法进行检测，检测结果如表2所示。
[0055]表2不同处理组土壤pH值、有效态镉含量、有效态铅含量和有机质含量
[0056]根据表2可知，单P1-4菌液的微生物菌剂和单R5菌液的微生物菌剂均可以有效治理矿山尾矿污染土壤，能够对矿山尾矿污染土壤中的镉、铅具有固定作用，能够提高环境pH，具有修复矿山尾矿污染土壤的作用，将P1-4菌液和R5菌液复配后的微生物菌剂效果明显优于单菌液的微生物菌剂，复配后的微生物菌剂对矿山尾矿污染土壤中的镉、铅具有极高的固定效率，并能稳定提高环境pH，有助于矿山尾矿污染土壤的快速修复，并且P1-4菌液和R5菌液复配的体积比不同，其治理矿山尾矿污染土壤的效果也存在差异，当P1-4菌液和R5菌液按照体积比为2：1的比例复配得到的微生物菌剂对于矿山尾矿污染土壤的治理效果最佳。
[0057]由以上实施例可知，本发明筛选鉴定得到了在镉环境中能够正常生长的细菌，为科萨克氏菌P1-4菌和寡养单胞菌R5菌，并基于两种菌的菌液制备了微生物菌剂用于修复矿山尾矿土壤，通过实验得知单P1-4菌液的微生物菌剂和单R5菌液的微生物菌剂均可以有效治理矿山尾矿污染土壤，对矿山尾矿污染土壤中的镉、铅具有固定作用，能够提高环境pH，具有修复矿山尾矿污染土壤的作用，将P1-4菌液和R5菌液复配后的微生物菌剂效果优于单菌液的微生物菌剂，复配后的微生物菌剂对矿山尾矿污染土壤中的镉、铅具有极高的固定效率，并能稳定提高环境pH，有助于矿山尾矿污染土壤的快速修复，由P1-4菌液和R5菌液以体积比为2：1的比例制备的微生物菌剂效果最佳，为矿山尾矿污染土壤提供了一种新的解决方法。
[0058]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
说明书附图(1)
