权利要求

1.一株修复镉铅锌复合污染的菌株，其特征在于，名称为多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)ZJA3，保藏编号为GDMCC NO：67330，所述多噬伯克霍尔德氏菌ZJA3具有去除镉铅锌复合污染以及解磷和解钾的促生特性。

2.权利要求1所述的菌株在修复镉铅锌复合污染中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用包括提高污染水体中接种所述多噬伯克霍尔德氏菌ZJA3的植物的株高和生物量。

4.一种修复镉铅锌复合污染的生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的菌株。

说明书

技术领域

[0001]本发明属于重金属污染生物修复技术领域，涉及一株修复镉铅锌复合污染的菌株及其应用。

背景技术

[0002]由于城市的迅猛发展以及农场粪便、污水污泥和化学肥料的广泛使用，过量的重金属会在土壤中积累。这些重金属能通过自然释放和人为活动持续进入生态系统，并因其高度的流动性和生物可利用性，极易通过食物链富集。

[0003]目前，针对重金属污染土壤的修复方法主要包括物理、化学及生物修复技术。相较于物化修复手段，生物修复技术因其成本相对较低且环境相容性更好而受到广泛关注。而大部分超富集植物存在植株矮小、生物量低、生长缓慢、修复周期长等局限性，因而可通过对超富集植物施加强化措施的方式提高修复效率，微生物联合植物强化修复措施是比较有效的生物修复途径。面对高地质背景区土壤重金属污染的特殊性与治理难题，微生物修复技术展现出其不可替代的巨大潜力。然而，筛选获得的耐性微生物往往功能单一，或仅具备重金属耐受性但缺乏促进植物生长的协同作用，难以在实现土壤修复的同时提升土地生产力。

发明内容

[0004]针对上述技术问题，本发明旨在提供一株修复镉铅锌复合污染的菌株及其应用，该菌株可用于多种重金属污染水体或土壤的治理修复且具有解磷和解钾的促生特性，为绿色、重金属原位治理提供了极具前景的解决方案。

[0005]本发明为实现技术目的采用的技术方案为：

[0006]本发明提供了一株修复镉铅锌复合污染的菌株，名称为多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)ZJA3，保藏编号为GDMCC NO：67330。

[0007]优选地，所述多噬伯克霍尔德氏菌ZJA3的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

[0008]优选地，所述多噬伯克霍尔德氏菌ZJA3对重金属镉(Cd)、铅(Pb)和锌(Zn)的最高耐受浓度分别大于80 mg/L、600 mg/L和1200 mg/L。

[0009]优选地，所述多噬伯克霍尔德氏菌ZJA3具有去除镉铅锌复合污染以及解磷和解钾的促生特性。

[0010]本发明还提供了上述菌株在修复镉铅锌复合污染中的应用。

[0011]优选地，所述应用包括去除污染水体或土壤中的镉铅锌以及解磷和解钾的促生作用。

[0012]更优选地，所述应用包括提高污染水体中接种所述多噬伯克霍尔德氏菌ZJA3的植物的株高和生物量。

[0013]本发明另提供了一种修复镉铅锌复合污染的生物菌剂，包括上述菌株。

[0014]本发明的有益效果在于：

[0015]本发明从云南矿区土壤中分离筛选出了一种能同时对镉铅锌具有高耐受性的多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)ZJA3，该菌株对重金属镉(Cd)、铅(Pb)和锌(Zn)的最高耐受浓度分别大于80 mg/L、600 mg/L和1200 mg/L;且该菌株能够有效去除污染水体中的Cd、Pb和Zn，去除率分别达到27.84%、98.38%、4.63%，后期有望用于多种重金属污染土壤的治理修复;同时，该菌株还具有解磷和解钾的促生特性，在Cd/Pb/Zn浓度为10µM/50 µM/100 µM时，王草植株接种多噬伯克霍尔德氏菌ZJA3，其株高和生物量分别是未经菌处理的1.14倍和2.71倍，具有明显的促生作用，本发明为绿色、重金属原位治理提供了极具前景的解决方案。

附图说明

[0016]图1为本发明多噬伯克霍尔德氏菌ZJA3的系统发育树。

[0017]图2为本发明多噬伯克霍尔德氏菌ZJA3在固体培养基上的生长状态。

[0018]图3为本发明多噬伯克霍尔德氏菌ZJA3对镉铅锌的去除效果。

[0019]图4为本发明多噬伯克霍尔德氏菌ZJA3的解磷作用。

[0020]图5为本发明多噬伯克霍尔德氏菌ZJA3的解钾作用。

[0021]图6为本发明多噬伯克霍尔德氏菌ZJA3对王草株高的变化。

[0022]图7为本发明多噬伯克霍尔德氏菌ZJA3对王草生物量的变化。

具体实施方式

[0023]下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明，以下具体实施例有助于本领域技术人员对进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

[0024]实施例

[0025]1、镉铅锌耐性微生物的筛选鉴定及保藏

[0026]称取5.0 g新鲜土壤样品(来自云南兰坪铅锌矿区)，加入盛有95 mL无菌水的锥形瓶中。充分混合后，将菌悬液涂布到含有Cd/Pb/Zn(20/50/100 mg/L)的LB固体培养基上(10g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、20 g/L琼脂)中。将平板在28 ℃下孵育3 d，观察菌落形态。挑选出不同形态特征的菌落富集培养，依次通过Cd/Pb/Zn复筛浓度30/100/200 mg/L、40/200/400 mg/L、50/400/800 mg/L、80/600/1200 mg/L获得耐性菌株。该菌株的最适培养温度为30℃，最适培养pH为6~7。将纯化后的抗性菌株送至基迪奥生物公司测序，经测序获得菌株16S rDNA序列(SEQ ID NO.1)提交到NCBI数据库，经比对，该耐性菌株为多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)，如图1所示。多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)ZJA3，已于2025年12月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，保藏编号为GDMCC NO：67330。

[0027]用接种环蘸取一环菌液在LB固体培养基上连续划线后，倒置放在30℃恒温培养箱中，2 d后观察菌株形态特征。如图2所示，该菌落在LB固体培养基上呈现圆形灰白色或淡黄色，中间微微凸起，表面光滑湿润。

[0028]对菌株进行氧化酶、葡萄糖发酵实验、硝酸盐还原试验、柠檬酸盐利用、明胶液化和淀粉水解等一系列相关生理生化实验，结果见表1。

[0029]表1为本发明多噬伯克霍尔德氏菌ZJA3的生理生化检测结果

[0030]注：“+”代表阳性，“-”代表阴性。

[0031]结果显示，该菌株能产生细胞色素氧化酶、不能利用葡萄糖、能将硝酸盐还原为亚硝酸盐，能利用柠檬酸盐，能液化明胶，能水解淀粉，不能利用L-阿拉伯糖和木糖，不能发酵甘露醇产酸，不具备活跃产生大量H2S的能力，缺乏活跃的色氨酸酶，吲哚实验为阴性。

[0032]2、多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)ZJA3对镉铅锌的去除效果。

[0033]以2%接种量，将菌株接种到含16/80/400 mg/L Cd/Pb/Zn的LB培养基中，30℃，摇床转速为160 rpm，连续培养96 h后取样，经8000 rpm，4℃离心10 min，上清液稀释一定倍数后用等离子体质谱(ICP-MS)测定上清液中的Cd、Pb和Zn浓度。去除率的计算方法：

[0034]重金属去除率=(重金属初始浓度-重金属终浓度)/重金属初始浓度×100%

[0035]经计算，本发明菌株多噬伯克霍尔德氏菌ZJA3在Cd/Pb/Zn复合重金属污染水体中，对Pb的去除率达到90%以上，如图3所示。

[0036]3、多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)ZJA3的解磷作用

[0037]PVK固体培养基(Modified Inorganic phosphorus Medium，改良解磷菌无机磷固体培养基)：称10 g葡萄糖、0.5 g (NH4)2SO4、0.03 g MgSO4•7H2O、0.03 g FeSO4•7H2O、15 g琼脂、0.3 g NaCl、0.3 g MgSO4•7H2O、0.3 g KCl、5 g Ca3(PO4)2、0.5 g 酵母抽提物到锥形瓶中，加水定容至1 L，调节pH为7.4。

[0038]取0.25 µL菌液接种至PVK固体培养基上，在30℃恒温培养箱中避光培养3 d后观察菌株周围是否有透明圈出现，结果如图4所示，可观察到菌株周围有透明圈，说明该菌株有解磷能力。

[0039]4、多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)ZJA3的解钾作用

[0040]解钾固体培养基：5 g蔗糖、0.5 g (NH4)2 SO4、0.5 g 酵母抽提物、0.3 g MgSO4•7H2O、2 g Na2HPO4、0.03 g FeSO4•7H2O、0.03 g MgSO4•H2O、2 g钾长石、15 g 琼脂到锥形瓶中溶解，然后在容量瓶中定容至1 L，调节pH为7.2。

[0041]取0.25 µL菌液接种至解钾固体培养基上，在30℃恒温培养箱中避光培养3 d后观察是否有透明油滴状菌落，结果如图5所示，可观察到有透明油滴状菌落，说明该菌株有解钾能力。

[0042]5、多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)ZJA3对王草的促生效果

[0043]采集王草茎秆，并将其切成长度约为7厘米左右的小段，每段茎秆均含有一个腋芽。使用去离子水清洗干净后，放入转运箱中用去离子水育苗。每天更换一次去离子水，培育十天后筛选出生长一致且健壮的幼苗。然后使用霍格兰(Hoagland)营养液，其主要成分(KNO3 607 mg/L、Ca(NO3)2 945mg/L、NH4NO3 115mg/L、Mg(NO3)2 493mg/L、FeSO4•7H2O 1.39g/L、乙二胺四乙酸二钠(EDTA. Na)为1.865 g/L)，微量元素包括 KI(0.83mg/L)、MnSO4(22.3 mg/L)、H3BO3(6.2 mg/L)、ZnSO4(8.6 mg/L)、Na2MoO4(0.25 mg/L)、CoCl2(0.025 mg/L)和CuSO4(0.025 mg/L)。培养液中加入由CdCl2•2.5H2O、Pb(NO3)2、ZnSO4•7H2O制备的重金属标准液，使营养液中Cd/Pb/Zn浓度为10 µM/50 µM/100µM。设置对照组(HM)和实验组(HM+ZJA3)。种植20天后，先测定采集的植物样品的株高，其次用蒸馏水反复清洗并在105℃、30min杀青后，在70℃下干燥至恒定重量为干重(DW)。

[0044]结果表明，本申请多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)ZJA3对王草具有明显的促生作用，具体表现在王草的株高和生物量上，如图6和7所示，在10 µM/50 µM/100µM的Cd/Pb/Zn溶液中，接种ZJA3的王草，在20天内，其株高和生物量分别为21 cm和0.42g，是未接种处理的1.14倍和2.71倍。因此，ZJA3具有促生作用，应用前景广阔。

[0045]显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

说明书附图(7)