简介： 本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种基于LC‑MS/MS法检测25‑羟基胆固醇的方法、试剂盒及其应用，该方法包括：对待测生物样本进行预处理；对经过预处理的待测生物样本进行LC‑MS/MS检测，得到所述待测生物样本的图谱，利用同位素内标法，以25‑羟基胆固醇‑d6为内标物，采用25‑羟基胆固醇标准品制作标准曲线定量，计算所述待测生物样本中的25‑羟基胆固醇的浓度；液相色谱条件包括：采用梯度洗脱，色谱柱为长度不大于50mm的EC‑C18色谱柱，流动相A为含甲酸的水溶液，流动相B为含甲酸的乙腈。本发明提供的方法灵敏度高、分析时间短。